A. miRNA電泳檢測(miREFA),miRNA橫流層析檢測見相關網頁。
MicroRNA(miRNA)為長度為18-23個堿基的單鏈核苷酸,參與細胞增殖、分化和死亡等生物過程,與許多疾病相關并可能成為疾病的生物標志物,為現(xiàn)代生物學與生物醫(yī)學熱門研究領域[9-10]。
人類miRNA已發(fā)現(xiàn)有近5千種,以其中的miRNA21為例,在Google學術限定搜索“miR 21”,結果顯示有428000篇文獻報道(Fig.1)。相信以“miR21"“miRNA 21”或“miRNA21"名字發(fā)表的文章應該不少,可見miRNA的研究之熱度。
現(xiàn)已開發(fā)了多種檢測 miRNA 的技術,包括用放射性標記的探針進行 RNA 印跡分析[11],基于微陣列[12]和基于聚合酶鏈式反應(PCR)的方法[13],液相單細胞測定[14],原位雜交[15-16]和高通量測序[17]等。然而,這些方法都有其固有的局限性,但是檢測 miRNA 依然面臨著重大挑戰(zhàn)。
Northern印跡法曾經是檢測miRNA的,廣泛使用標準方法,可以檢測miRNA的相對分子大小和豐度,但其也存在低通量、耗時長、易降解等缺點,并且敏感度較低,無法檢測到分子量較低的miRNA。
實時定量PCR(quantitativereal-timePCR,qRT- PCR)具有動態(tài)范圍大、靈敏度高、序列特異性強等優(yōu)點,已成為檢測miRNA表達的常規(guī)和可靠技術。 但qRT-PCR測定的miRNA并非樣品的實際表達量,難于區(qū)分miRNA之間的單核苷酸差異,并且還有假陽性以及引物設計困難的問題。
微陣列技術是一種快速、高通量檢測miRNAs的方法,但成本高,不能檢測分子量較低的miRNA,對序列相似的miRNA的分辨性不好,也有假陽性問題。
一些學者開發(fā)了各種等溫分析技術,包括滾環(huán)擴
增(RCA),指數(shù)擴增反應(EXPAR),環(huán)介導的等溫擴增(LAMP),雜交鏈反應和催化發(fā)夾組裝。盡管這些測定具有簡單甚至無需儀器操作的優(yōu)點,但也存在限制其廣泛應用的缺點,例如EXPAR和LAMP的非特異性擴增和高背景信號,以及雜交鏈反應和催化發(fā)夾組裝的相對較慢的動力學和低靈敏度。
B. miREFA的技術優(yōu)勢
微奧基因(viagene)公司開發(fā)的快速microRNA Electrophoretic Fluorescence Assay (miREFA) 是檢測miRNA的有力工具,其工作原理是基于分子雜交,未雜交的探針比與RNA/DNA與探針的雜交體的分子量小,導致在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠中移動速度變化,游離探針與雜交體位置不同,探針在電泳膠中的位置通過熒光標記物在熒光掃描儀或成像儀顯現(xiàn)。 MiREFA具有以下優(yōu)勢與特點。
1)快速出結果:miREFA技術能夠使分子雜交在短時間內完成,全部測定包括電泳可以在2小時內完成(Fig.2,時間安排)。
2)靈敏度高:miREFA kits使用近紅外標記探針,并采用特殊方法大大提高檢測靈敏度,能夠測定飛克摩水平的miRNA(Fig.3
3)操作簡便:miREFA在現(xiàn)有miRNA檢測方法中為最簡便的操作技術,簡單操作與快速出結果能大大降低樣品降解(見操作說明書)。
4)分辨率高:miREFA技術能夠分辨同種miRNA間的單個堿基長短變化(圖4),能鑒別區(qū)分單個堿基突變,也能區(qū)分miRNA前體與成熟miRNA。
5)樣品絕對量檢測:miREFA所測定的是單位樣品體積中的miRNA絕對量,不涉及任何擴增、放大。
6)定量檢測:miREFA能夠對所測定的miRNA進行定量分析。
C. miREFA所需要的試劑與條件:
1)熒光標記探針:微奧基因的即用kit已包括探針,客戶也可向我們定制個性化探針。
2)需要能使探針與目標分子快速雜交的試劑以及用于檢測miRNA的電泳系統(tǒng),微奧基因的即用kti已包括所有試劑。
3)需要米REFA專用垂直電泳預制膠(微奧基因產品,選購項)或按照說明用Kit所帶試劑配置專用變性膠。
5)客戶需要自備能夠對IR700熒光進行圖像掃描的儀器(如Li Cor公司的Odyssey 近紅外熒光掃描儀)或任何能夠檢測700nm熒光的成像儀(客戶自備)。
微奧基因提供的快速miRNA檢測技術涉及多項美國專利與技術秘密。由于時間有限,現(xiàn)僅提供有限類別的miRNA測定Kits,如Let-7、miRNA21、MiRNA122、MiRNA144,MiRNA145、MiRNA155的檢測。
為使客戶能夠開展其它類別的mRNA檢測,現(xiàn)開展為期兩個月的優(yōu)惠活動;凡是訂購我司尚未開發(fā)的miRNA檢測,客戶在購買miREFA通用試劑基礎上,個性化訂購檢測miRNA的探針享受50%優(yōu)惠(miRNA檢測探針涉及多個熒光分子標記,正常價格2100元)。
微奧基因的miRNA測定Kits按標簽顯示溫度存放,可以保存一年。