【Pulldown工作原理】

DNA/RNA Pulldown(Pull-down)是一種用于研究核酸與蛋白質相互作用的體外實驗技術，是研究基因調控機制的重要工具。其工作原理為；鏈親和素磁珠能夠與生物素標記的核酸/蛋白復合物結合。 在磁場下或通過離心使結合物與上清液分離，吸棄上清液并洗滌磁珠，然后用解離液使蛋白質變性而與磁珠解離。解離液中的蛋白質可直接通過質譜或通過Western Blotting（WB）進行鑒定。解離液也 可以用SDS PAGE 或雙向電泳分離，并用高敏考馬斯亮藍（CBB）染色，從染色膠上切下的蛋白帶進行質譜分析（見圖1與2）。

【Pulldown實驗步驟】

  Pulldownd基本步驟如下：

1. 設計及標記探針：針對目標基因的調控區域設計特異性DNA探針，通常使用脫硫生物素進行標記。
2. 制備樣品：依不同實驗目的，樣品可以是細胞核蛋白、胞漿蛋白、全細胞或菌液、或純化蛋白。
3. 孵育：將制備的樣品液與標記探針共同孵育，使DNA結合蛋白與靶向序列結合，然后與親和素磁珠孵育，使形成蛋白-核酸-生物素-親和素磁珠復合物。
4. 純化和洗滌：通過親和素磁珠純化蛋白質-DNA復合物，洗滌去除未結合及非特異性結合的蛋白質。
5. 結合與分離：通過解離液將結合蛋白從復合物解離出來。
6. 蛋白質檢測：使用WB 或質譜鑒定與核酸結合的蛋白質類型。

【Pulldown種類】

依據標記探針的結合對象，Pulldown分為直接法與間接法（見相關介紹）：如果標記DNA/RNA探針直接與蛋白結合，對下拉的蛋白進行分析鑒定的實驗稱為直接Pulldown。標記探針不與蛋白結合，通過與目標DNA/RNA雜交，分析鑒定下拉目標DNA/RNA的結合蛋白的方法稱為間接Pulldown。

依據所用探針以及實驗目的是用于分析DNA還是RNA結合蛋白，Pulldown可分為DNA Pulldown 與 RNA Pulldown兩大類。

直接法Pulldown有兩種：1）用已知結合序列的DNA/RNA探針探查相應結合蛋白，檢測意義與EMSA相似，可準確確定核酸/蛋白復合物的組分以及結合蛋白家族成員的亞單位。2）用未知或不確定結合序列的DNA/RNA片段探查結合蛋白。用這種Pulldown需要有純化的DNA/RNA片段并對片段進行標記，需要確定結合蛋白數量與種類，以及蛋白與DNA/RNA的結合序列，變量較多，后期分析工作量大。

間接法Pulldown也分為DNA或RNA Pulldown兩類，可用于；1）探測與長鏈DNA/RNA分子結合的已知或未知蛋白，2）確定與長鏈DNA/RNA分子結合的多種蛋白成分，3）用于分析與各種非編碼RNA（circRNA、lncRNA、eRNA等）或DNA結合的蛋白。

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