A. miRNA測(cè)定方法

MicroRNA（miRNA）為長度為18-23個(gè)堿基的單鏈核苷酸，參與細(xì)胞增殖、分化和死亡等生物過程，與許多疾病相關(guān)并可能成為疾病的生物標(biāo)志物，為現(xiàn)代生物學(xué)與生物醫(yī)學(xué)熱門研究領(lǐng)域[9-10]。

人類miRNA已發(fā)現(xiàn)有近5千種，以其中的miRNA21為例，在Google學(xué)術(shù)限定搜索“miR 21”，結(jié)果顯示有428000篇文獻(xiàn)報(bào)道（圖1）。相信以“miR21"“miRNA 21”或“miRNA21"名字發(fā)表的文章應(yīng)該不少，可見miRNA的研究之熱度。

 現(xiàn)已開發(fā)了多種檢測(cè) miRNA 的技術(shù)，包括用放射性標(biāo)記的探針進(jìn)行 RNA 印跡分析[11]，基于微陣列[12]和基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法[13]，液相單細(xì)胞測(cè)定[14]，原位雜交[15-16]和高通量測(cè)序[17]等。然而，這些方法都有其固有的局限性，但是檢測(cè) miRNA 依然面臨著重大挑戰(zhàn)。

Northern印跡法曾經(jīng)是檢測(cè)miRNA的，廣泛使用標(biāo)準(zhǔn)方法，可以檢測(cè)miRNA的相對(duì)分子大小和豐度，但其也存在低通量、耗時(shí)長、易降解等缺點(diǎn)，并且敏感度較低，無法檢測(cè)到分子量較低的miRNA。

實(shí)時(shí)定量PCR(quantitativereal-timePCR，qRT- PCR)具有動(dòng)態(tài)范圍大、靈敏度高、序列特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為檢測(cè)miRNA表達(dá)的常規(guī)和可靠技術(shù)。 但qRT-PCR測(cè)定的miRNA并非樣品的實(shí)際表達(dá)量，難于區(qū)分miRNA之間的單核苷酸差異，并且還有假陽性以及引物設(shè)計(jì)困難的問題。

微陣列技術(shù)是一種快速、高通量檢測(cè)miRNAs的方法，但成本高，不能檢測(cè)分子量較低的miRNA，對(duì)序列相似的miRNA的分辨性不好，也有假陽性問題。

一些學(xué)者開發(fā)了各種等溫分析技術(shù)，包括滾環(huán)擴(kuò)增（RCA），指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)（EXPAR），環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（LAMP），雜交鏈反應(yīng)和催化發(fā)夾組裝。盡管這些測(cè)定具有簡單甚至無需儀器操作的優(yōu)點(diǎn)，但也存在限制其廣泛應(yīng)用的缺點(diǎn)，例如EXPAR和LAMP的非特異性擴(kuò)增和高背景信號(hào)，以及雜交鏈反應(yīng)和催化發(fā)夾組裝的相對(duì)較慢的動(dòng)力學(xué)和低靈敏度。

B. miREFA的技術(shù)優(yōu)勢(shì)

Viagene(微奧基因）公司開發(fā)的快速microRNA Electrophoretic Fluorescence Assay (miREFA) 是檢測(cè)miRNA的有力工具，其工作原理是基于分子雜交，未雜交的探針比與RNA/DNA與探針的雜交體的分子量小，導(dǎo)致在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠中移動(dòng)速度變化，游離探針與雜交體位置不同，探針在電泳膠中的位置通過熒光標(biāo)記物在熒光掃描儀或成像儀顯現(xiàn)。 MiREFA具有以下優(yōu)勢(shì)與特點(diǎn)。

1）快速出結(jié)果：miREFA技術(shù)能夠使分子雜交在20分鐘內(nèi)完成，全部測(cè)定可以在2小時(shí)內(nèi)完成（圖2，時(shí)間安排）。

2）靈敏度高：miREFA kits使用近紅外標(biāo)記探針，并采用特殊方法大大提高檢測(cè)靈敏度，能夠測(cè)定飛克摩水平的miRNA（圖

3）檢測(cè)靈敏度）。 3.操作簡便：miREFA在現(xiàn)有miRNA檢測(cè)方法中為最簡便的操作技術(shù)，簡單操作與快速出結(jié)果能大大降低樣品降解（見操作說明書）。

4）分辨率高：miREFA技術(shù)能夠區(qū)分同種miRNA間的單個(gè)堿基變異（圖4），也能區(qū)分miRNA前體與成熟miRNA。

5）絕對(duì)量檢測(cè)：miREFA不涉及任何擴(kuò)增，所測(cè)定的是單位樣品體積中的miRNA絕對(duì)量。

6）定量檢測(cè)：miREFA能夠?qū)λ鶞y(cè)定的miRNA進(jìn)行定量分析。

C. miREFA所需要的條件：

1）近紅外熒光標(biāo)記探針（Viagene的成套試劑已包括，或選用探針定制服務(wù)）。

2）近紅外熒光探針與樣品反應(yīng)結(jié)合液（Viagene的成套試劑已包括）。

3）樣品上樣液（Viagene的成套試劑已包括）。

4）用于EMSA的預(yù)制凝膠板（Viagene產(chǎn)品，選購項(xiàng)）。

5）Li Cor公司近紅外熒光掃描儀或任何能夠?qū)?00nm熒光進(jìn)行掃描或成像的儀器（客戶自備）。

Viagene提供的快速miRNA檢測(cè)技術(shù)涉及多項(xiàng)美國專利與技術(shù)秘密。由于時(shí)間有限，現(xiàn)僅提供有限類別的miRNA測(cè)定Kits，如Let-7、miRNA21、MiRNA122、MiRNA144，MiRNA145、MiRNA155的檢測(cè)。為使客戶能夠開展其它類別的mRNA檢測(cè)，現(xiàn)開展為期兩個(gè)月的優(yōu)惠活動(dòng)；凡是我司尚未開發(fā)的miRNA檢測(cè)Kit，客戶只需要在成套試劑價(jià)格基礎(chǔ)上增加600元，我們就可以為客戶開發(fā)一套針對(duì)特定miRNA的測(cè)定kit。

Viagene的miRNA測(cè)定Kits按標(biāo)簽顯示溫度存放，可以保存一年。