【產(chǎn)品包裝與價(jià)格】

產(chǎn)品類別	目錄號(hào)	規(guī)格	價(jià)格	描述
DNA-Prot. Pulldwon	SINP020 SINP021	10次 20次	2995元 4542元	包括DNA Pulldown試劑、結(jié)合蛋白分離試劑、凝膠電泳與染色試劑、詳細(xì)操作說(shuō)明（隨試劑發(fā)貨）。
RNA-Prot. Pulldwon	SINP022 SINP023	10次 20次	3995元 6592元	包括RNA Pulldown試劑、結(jié)合蛋白分離試劑、凝膠電泳與染色試劑、詳細(xì)操作說(shuō)明（隨試劑發(fā)貨）。
注：（1）訂貨須在目錄號(hào)后加規(guī)格。（2）微奧基因還提供DNA-protein與RNA-protein pulldown 服務(wù)（查看）。

【工作原理】

DNA-protein Pulldown/Pull-down試劑盒用于從組織與細(xì)胞樣品中純化DNA-結(jié)合蛋白。其工作原理為；

鏈親和素磁珠能夠與生物素標(biāo)記DNA/蛋白復(fù)合物結(jié)合。在磁場(chǎng)下或通過(guò)離心使結(jié)合物與上清液分離，吸棄上清液并洗滌磁珠，然后用SDS樣品液使蛋白變性而與磁珠分離。分離液中的蛋白質(zhì)用SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或雙向電泳分離，SDS PAGE用高靈敏度考馬斯亮藍(lán)（CBB）染色。然后從染色膠上切下所需蛋白帶進(jìn)行質(zhì)譜分析，確認(rèn)蛋白種類與類型。

主要操作步驟見(jiàn)右邊圖1與圖2。

【產(chǎn)品特點(diǎn)】

1. 結(jié)合反應(yīng)特異性高，非特異結(jié)合少。

2. SDS PAGE 染色帶清晰、銳利。

3. 染色靈敏度高，可以純化很少量的DNA結(jié)合蛋白（圖3）。

4. Pulldown的蛋白適合質(zhì)譜分析。

【試劑盒組份】

1. 鏈親和素磁珠。

2. 生物素標(biāo)記質(zhì)控DNA探針。

3. DNA-蛋白或RNA-蛋白結(jié)合反應(yīng)液。

4. DNA或RNA親和純化洗液。

5. SDS 樣品液。

6. SDS PAGE 預(yù)制膠

7. SDS PAGE 染色液。

8. SDS PAGE 脫色液。

9. 操作說(shuō)明書(shū)。

【需要的其它設(shè)備與材料】

參考產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)

【適用范圍】

1. 鑒定未知DNA/RNA結(jié)合蛋白；在一些情況下（如 Circle-RNA、lncRNA等），可能并不知道與DNA/RNA結(jié)合的有哪些蛋白、是些什么蛋白。使用本試劑盒結(jié)合質(zhì)譜分析能夠?qū)ξ粗Y(jié)合蛋白進(jìn)行鑒定，不需要使用純化蛋白或抗體。

2. 鑒定DNA結(jié)合蛋白的組份；許多轉(zhuǎn)錄因子都是多種蛋白的多聚體。例如NFkB有P65，P52，P50，C-rel 和Rel-B 5種亞單位?；罨腘FkB為相同或不同亞單位之間的二聚體，鑒定NFkB的亞單位常用Supershift （超遷移）EMSA，需要使用針對(duì)各種NFkB亞單位的抗體，價(jià)格不菲。使用試劑盒可以NFkB亞單位代替Supershift （超遷移）EMSA 對(duì)DNA-蛋白復(fù)合物的亞單位進(jìn)行鑒定，不需使用任何抗體。

3. 鑒定DNA結(jié)合蛋白與其它蛋白的相互作用 ；一些轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合還需要一些不與DNA結(jié)合蛋白的參與。使用本產(chǎn)品能夠同時(shí)對(duì)DNA結(jié)合蛋白與非DNA結(jié)合蛋白進(jìn)行鑒定。

【注意事項(xiàng)】

1. 本試劑能夠與微奧基因的EMSA成套試劑無(wú)縫銜接。但如果使用Thermo，Signosis或碧云天的EMSA試劑，可能達(dá)不到理想效果或?qū)е峦耆　Ｆ湓蚴且驗(yàn)椴煌瑥S家所用的結(jié)合反應(yīng)液成分不同，不同反應(yīng)液對(duì)同一種轉(zhuǎn)錄因子的測(cè)定會(huì)有明顯差異（見(jiàn)圖4）。

2. 使用本產(chǎn)品前，建議先進(jìn)行常規(guī)EMSA測(cè)定。EMSA測(cè)定可以提供以下信息；

1）有沒(méi)有在EMSA測(cè)定中看到DNA與蛋白的結(jié)合帶。明顯的EMSA結(jié)合帶預(yù)示好的鑒定結(jié)果。

2）EMSA結(jié)合帶的強(qiáng)弱提示Pulldown的反應(yīng)體積；結(jié)合帶強(qiáng)、樣品核蛋白用量少，反應(yīng)體系體積小。

3）EMSA測(cè)定中有沒(méi)有非特異條帶或高背景；如果非特異條帶明顯，需要使用相同細(xì)胞株的陰性對(duì)照來(lái)確定純化后的非特異帶譜。

3. 請(qǐng)嚴(yán)格按照操作手冊(cè)進(jìn)行操作。如果遇到問(wèn)題，請(qǐng)用生物素標(biāo)記質(zhì)控探針與核蛋白樣品進(jìn)行Pulldown 實(shí)驗(yàn)。生物素標(biāo)記質(zhì)控探針?biāo)鶞y(cè)定的DNA結(jié)合蛋白存在于幾乎所有細(xì)胞核中，Pulldown的上清液在用考馬斯亮藍(lán)染色的PAGE膠中，應(yīng)會(huì)看到為蛋白帶。陰性結(jié)果提示 1）樣品中核蛋白降解核蛋白，2）用于pulldown的核蛋白總量不夠，3）樣品中的核蛋白濃度太稀，4）核蛋白在提取過(guò)程中丟失，提示需要重新制作核蛋白樣品并做結(jié)合蛋白的EMSA鑒定。

 

 

 

 

 

 

Pic. 3, 20ul、10ul、5ul、2.5 ul、1.25ul 細(xì)胞裂解液重復(fù)加入SDS PAGE膠。電泳后，凝膠板切成左右兩片，分別用微奧基因與Thermo的考馬斯亮藍(lán)（CBB）染色。
Pic. 4, 用鏈親和素磁珠Pulldwon 的DNA-結(jié)合蛋白（電泳道1-5用微奧基因 CBB染色，電泳道6-7用碧*天CBB染色）：1，從EMSA測(cè)定陽(yáng)性的樣品pulldown的未知結(jié)合蛋白，2，EMSA測(cè)定陰性樣品的pulldown結(jié)果。泳道2使用與泳道1相同細(xì)胞株，但細(xì)胞沒(méi)有經(jīng)過(guò)激活處理。3與4，為NFkB EMSA 陽(yáng)性與陰性樣品的pulldown結(jié)果。結(jié)合質(zhì)譜分析，能夠鑒定NFkB的亞單位。5，蛋白分子Marker。6與7，樣品與pulldown操作與泳道3與4相同。Pulldown蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，用碧*天CBB染色。