• 一、為什么需要EMSA陰性陽性對照

  

• 通過電泳技術(shù)確定目標(biāo)分子位置時，一般都會放分子量參考物。Western Blotting （WB）使用蛋白分子量Marker，DNA/RNA電泳使用DNA/RNA 分子量Markers 來確定目標(biāo)分子的位置。 在蛋白與核酸電泳分析中不用Marker會導(dǎo)致無法確認(rèn)目標(biāo)分子。同樣，在EMSA測定中，不用參照物會造成結(jié)果分析困難。

• EMSA是用非變性膠來分析天然蛋白遷移率。在非變性膠中的蛋白遷移率受許多因素影響；

1）蛋白分子量大的移動慢。但由于EMSA的PAGE 膠濃度很低（相對于WB的濃縮膠），對大蛋白的分離遠(yuǎn)不及WB。
2）天然蛋白質(zhì)的3D構(gòu)型會影響電泳遷移率；小的絲狀蛋白可能比分子量大很多的球形蛋白移動慢。
3）蛋白質(zhì)所帶電荷的極性與強(qiáng)弱會影響電泳遷移率; 帶負(fù)電荷多的移動快。
4）蛋白與蛋白結(jié)合會遷移率；如多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子都需與別蛋白結(jié)合而發(fā)揮作用。
5）蛋白與不同類型探針結(jié)合遷移率會有差別。非放射性標(biāo)記探針的標(biāo)記物也會影響目標(biāo)蛋白遷移率。

• 二、如何制備或獲得EMSA對照

• 做EMSA的目的不是用來判斷目標(biāo)蛋白大小，而是找出核酸/蛋白復(fù)合物的位置。因而，在EMSA膠中放分子量Marker沒有用，也不能WB的Marker。 一般會在實(shí)驗(yàn)時，同時進(jìn)行EMSA陰性陽性對照的結(jié)合反應(yīng)，一起跑電泳。制備EMSA對照，尤其陽性對照，可以參照文獻(xiàn)，采用大家公認(rèn)的方式進(jìn)行并且經(jīng)過EMSA確認(rèn)。

  以我們做的NFkB對照為例，陽性對照的制備如下；培養(yǎng)Mo7e細(xì)胞3天左右，頭天放無血清培養(yǎng)基過夜，第二天上午用腫瘤壞死因子（TNF-a）處理1小時，然后抽提核蛋白， 測定蛋白濃度，做NFkB的EMSA分析。陽性樣品分裝后放-80oC保存。即使這樣處理，仍然有25%的幾率，NFkB的EMSA結(jié)果為陰性，可能與細(xì)胞生長有關(guān)。

  三、如果選擇EMSA對照

  （1）如有可能，盡量選用與實(shí)驗(yàn)蛋白因子相同的EMSA對照，有以下好處；1）能夠準(zhǔn)確指示目標(biāo)帶的位置，2）使用相同探針有助于確定實(shí)驗(yàn)條件，3）容易找出EMSA測定中的問題，4）帶陰陽對照的圖譜可以一起發(fā)表。

  （2）當(dāng)制備與實(shí)驗(yàn)蛋白因子相同的對照不易或不可行時，也可采用以結(jié)合蛋白位置相近的已知陽性結(jié)合蛋白做對照（實(shí)際上，WB與核酸電泳中的分子Marker都實(shí)驗(yàn)樣品不同）， 但陽性對照與實(shí)驗(yàn)樣品的物種來源不要差別太大。對動物與人的許多轉(zhuǎn)錄因子而言，陽性結(jié)合帶都會出現(xiàn)在特定區(qū)域，許多都可以互作對照。如果客戶對位置判斷有問題，微奧基因可以協(xié)助解決。

  （3）如果陽性對照的結(jié)合帶位置與EMSA目標(biāo)分子差別很大，作為陽性對照的意義不大。Thermo公司的Lightshift 中的EBNF陽性對照就沒有什么實(shí)際意義；

  1）EBNF結(jié)合帶位置比非特異結(jié)合帶都低，位于游離探針上面一點(diǎn)，不能幫助判斷絕大多數(shù)DNA/RNA結(jié)合蛋白的位置。
  2）EBNF對照所用探針與樣品與實(shí)驗(yàn)測定完全不一樣。EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果未達(dá)預(yù)期可能是由于核蛋白丟失，蛋白降解，蛋白因子未活化，探針不結(jié)合等原因，但與EBNF對照有無結(jié)合帶出現(xiàn)半毛錢關(guān)系都沒有。
  3）在同一片膠中用EBNF對照的理由是可確定電泳與測定系統(tǒng)是否工作。理論上，如果跑電泳，轉(zhuǎn)膜，紫外交聯(lián)，Biotin/Avidin反應(yīng)，或ECL底物出問題，就可能看不到EBNF結(jié)合帶。但實(shí)際上，出現(xiàn)上述問題時，游離探針也會看不到，何必要看EBNF帶。
  4）在把實(shí)驗(yàn)圖用于文章發(fā)表時，需要將EBNF對照帶切掉。如果用于發(fā)表的圖中實(shí)驗(yàn)樣品都有了結(jié)合帶，還用得著用EBNF對照來證明EMSA檢測系統(tǒng)是否工作嗎？！

  四、微奧基因的EMSA對照與價格

  微奧基因所有的陽性與陰性對照的數(shù)量與類別為業(yè)界最全，所有的陽性與陰性對照都經(jīng)過EMSA測定，保證品質(zhì)。現(xiàn)有的陽陰性對照有NFkB，AP1，SP1，OCT1，OCT2，OCT2，NRF2，GATA，STATs，WT-1，EF2，P53，GLI，Burnx1等...