初次接觸EMSA的人面對(duì)市場(chǎng)上各種EMSA試劑可能出現(xiàn)選擇困難。網(wǎng)上也常看到有”如何選擇EMSA試劑盒“的求助。微奧基因從事EMSA產(chǎn)品開發(fā)與服務(wù)有10年，有豐富經(jīng)驗(yàn)，對(duì)市場(chǎng)情況非常了解，下面的意見供參考。

【A】選用EMSA試劑盒的一般原則。

1. 產(chǎn)品的成熟程度：產(chǎn)品在市場(chǎng)上有多少時(shí)間，有多少人用過。
2. 是否有完整EMSA產(chǎn)品鏈：做EMSA需要各種相關(guān)試劑。如果服務(wù)商本身都沒有條件做EMSA，可以認(rèn)定所出售的
     EMSA試劑盒根本沒經(jīng)過檢驗(yàn)。
3. 了解公司的技術(shù)力量：購(gòu)貨前可向商家問一些EMSA技術(shù)問題。如果商家的知識(shí)還沒有客戶懂得多，F(xiàn)orget it !!!
4. 了解用戶滿意度：有多少人用過，滿意度怎么樣。
5. 是否有與產(chǎn)品相關(guān)的文章發(fā)表：盡管沒有文章并不能證明產(chǎn)品好壞，但有相關(guān)文章發(fā)表肯定對(duì)試劑選擇有加分。
6. 不要混用幾家公司產(chǎn)品：因?yàn)?1）不同廠家所用的產(chǎn)品成分各有不同，混合使用很可能不工作。2）會(huì)導(dǎo)致難于找出
    EMSA遇到的問題。3）如果結(jié)果不理想，都不知道向那家公司求助。

例如，某位客戶所用的樣品是鼠腦組織，EMSA試劑盒是碧云天的，核蛋白提取是Thermo的，探針序列是網(wǎng)上找的，Oligoes是生工合成，雙鏈探針是自己做的，用的是Minipore Hypond膜，做實(shí)驗(yàn)沒有TF對(duì)照。該客戶的問題是圖譜只顯示游離探針帶，沒有結(jié)合帶。對(duì)類似的求助，我們很難提供有效幫助。

【B】發(fā)光法EMSA試劑盒比較。市場(chǎng)上天恩澤的“另頁(yè)。熒光法EMSA的比較詳見有關(guān)介紹。

	LightShift	DIG-EMSA	EMSA kit	CoolShift	CoolShift	完全EMSA
生產(chǎn)廠商	Thermo	Roche	Signosis	微奧基因
結(jié)合反應(yīng)液	＋	＋	＋	＋	＋	＋
Poly[dI: dC]	＋	＋1	＋	＋	＋	＋
Poly[dA: dT]	－	＋1	－	－	－	－
Poly Lysine	－	＋1	－	－	－	－
抗DIG抗體	－	＋	－	－	－	－
DIG標(biāo)記Kit	－	＋	－	－	－	－
上樣液	＋	＋	＋	＋	＋	＋
親和素-HRP	＋	－	＋	＋	＋	＋
發(fā)光底物	HRP	AKP	HRP	HRP	HRP	HRP
膜封閉液	＋	＋	＋	＋	＋	＋
膜洗液	＋	－	＋	＋	＋	＋
HRP平衡液	＋	－	＋	＋	＋	＋
生物素探針	－	－	＋	－	＋	＋
專用轉(zhuǎn)運(yùn)膜	－	－	＋	－	＋	＋
MgCL2	＋	－	－	－10	－10	－10
KCL8	＋	－	－	－10	－10	－10
NP408	＋	－	－	－10	－10	－10
Glycerol8	＋	－	－	－10	－10	－10
EDTA8	＋	－	－	－10	－10	－10
BSA8	＋	－	－	－10	－10	－10
質(zhì)控標(biāo)記探針	＋3	＋4	－	＋5	－	＋5
競(jìng)爭(zhēng)探針	－	－	－	option	option	＋
突變探針	－	－	－	option	option	＋
質(zhì)控蛋白	＋6	＋7	－	option	option	option
陰性對(duì)照9	－	－	－	option	option	option
陽性對(duì)照9	－	－	－	option	option	option
EMSA預(yù)制膠	－	－	－	option	option	option
EMSA電泳液	－	－	－	option	option	option
測(cè)定樣品數(shù)	100	100	30	100	100	30/50
注1. Roche 通過Poly[dI: dC]、Poly[dA: dT]與Poly Lysine的用量來控制DIG EMSA的背景與結(jié)合帶強(qiáng)弱。生物素與熒光EMSA通常是通過Poly[dI: dC] 。一些公司還使用額外成分控制EMSA的背景，微奧基因經(jīng)過 注3-5. Thermo試劑配EBNA探針與EBNA6，Roche配OCT2A探針與OCT2A做試劑質(zhì)控7，與客戶樣品的測(cè)定條件沒有關(guān)系。微奧基因的質(zhì)控探針帶多個(gè)看家基因結(jié)合位點(diǎn)，能夠與客戶的核提取產(chǎn)生結(jié)合帶，除了用作試劑質(zhì)控，還能直接確定客戶樣品質(zhì)量。 注9. 微奧基因供應(yīng)數(shù)十種與客戶待測(cè)轉(zhuǎn)錄因子相同的陽性/陰性對(duì)照。 注10. 有關(guān)成分已經(jīng)整合到特定轉(zhuǎn)錄因子的反應(yīng)液中。測(cè)定條件已經(jīng)確定，不需要客戶再做優(yōu)化。

 

【C】市場(chǎng)產(chǎn)品點(diǎn)評(píng)。

1. 關(guān)于Thermo的LightShift試劑盒

優(yōu)點(diǎn) -- 1）非放射性，生物素/ECL系統(tǒng)，靈敏度高，2）適用于未知結(jié)合條件的測(cè)定，3）試劑量大，4）穩(wěn)定，5）帶EBNF陽性對(duì)照*。
缺點(diǎn) -- 1）價(jià)格貴，5000元/套。2）非即用試劑盒；客戶需要制備或另購(gòu)探針。對(duì)首次接觸EMSA的客戶，所制作的探針可能不工作。3）測(cè)定條件需摸索。以NFkB為例，用所配“優(yōu)化劑”做EMSA會(huì)出現(xiàn)多種結(jié)合帶（右圖），需要時(shí)間、錢財(cái)與經(jīng)驗(yàn)來確定結(jié)合帶。用于測(cè)定未知TF，會(huì)導(dǎo)致判斷困難。4）不帶轉(zhuǎn)運(yùn)膜。做EMSA須另購(gòu)強(qiáng)正電尼龍膜（EMSA不能使用NC與PVDF）。 5）EBNF對(duì)照意義不大*（下面解釋）。6）在國(guó)內(nèi)難于獲得有力技術(shù)支持。
*注EBNF對(duì)照用處不大，因?yàn)? 1）EBNF分子很小，結(jié)合帶在游離探針上面一點(diǎn)，遠(yuǎn)離常見的TF結(jié)合區(qū)，難于用作標(biāo)準(zhǔn)判斷樣品的位置。2）EBNF反應(yīng)條件與實(shí)際樣品非常不同。EMSA失敗一般是由于核蛋白丟失、蛋白降解、蛋白因子未活化、探針不結(jié)合或?qū)嶒?yàn)失誤等原因，但與EBNF有無結(jié)合關(guān)系不大。3）理論上，當(dāng)電泳、轉(zhuǎn)膜、紫外交聯(lián)、酶反應(yīng)、洗膜或ECL底物環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題時(shí)，EBNF帶會(huì)看不到。實(shí)際操作中，如果游離探針都看不到本身就提示實(shí)驗(yàn)在前述環(huán)節(jié)出了問題，沒有非用EBNF的理由。4）再者，用于發(fā)文的EMSA圖是不會(huì)帶EBNF帶的，需要裁剪掉。

2.  關(guān)于Roche地高辛（DIG）標(biāo)記EMSA試劑盒

優(yōu)點(diǎn) -- 1）非放射性，2）適用于未知結(jié)合條件的TF測(cè)定，3）試劑量大，4）穩(wěn)定，5）帶OCT2A陽性對(duì)照*。
缺點(diǎn)-- 為最早的非放射性EMSA試劑，但與后來開發(fā)的生物素/熒光EMSA相比，已沒有任何優(yōu)勢(shì)。1）非即用型試劑盒，到貨后要標(biāo)記探針，配制膜洗液與購(gòu)買轉(zhuǎn)運(yùn)膜等。2）貴；7000多一套，比任何EMSA試劑盒都貴。 3）工作量大；DIG標(biāo)記手工進(jìn)行，標(biāo)記率低。相比之下，生物素/紅外熒光標(biāo)記在機(jī)器合成核酸時(shí)進(jìn)行，與訂購(gòu)引物一樣簡(jiǎn)單。 4）費(fèi)時(shí)；手工標(biāo)記探針需要兩天時(shí)間。此外、DIG發(fā)光檢測(cè)是基于半抗原/抗體反應(yīng)，親和性低，需要2天才能見到結(jié)果。而生物素/親和素的結(jié)合比抗原/抗體強(qiáng)萬倍，~5小時(shí)左右就能出結(jié)果。近紅外熒光EMSA更將檢測(cè)時(shí)間縮短到~2小時(shí)。5）背景高；DIG的抗原/抗體反應(yīng)只能在溫和條件下孵育。相比之下，生物素/親和素結(jié)合能經(jīng)歷嚴(yán)苛的孵育與洗滌條件，圖譜更漂亮。 6）靈敏度低；DIG系統(tǒng)使用堿性磷酸酶（AKP）系統(tǒng)（說明書要求曝光15-30分鐘），其靈敏度遠(yuǎn)不如HRP（曝光1-5分鐘）。如果使用成像儀，AKP的結(jié)果很難看到。 5）國(guó)內(nèi)很難獲得技術(shù)支持。

3. 關(guān)于Signosis EMSA試劑盒

優(yōu)點(diǎn) -- 1）非放射性生物素/ECL系統(tǒng)，靈敏度高。2）帶探針與膜的即用型。
缺點(diǎn) -- 1）價(jià)格貴，4500元/30次測(cè)定。2）選擇有限，無法進(jìn)行個(gè)性化或SNP測(cè)定。3）國(guó)內(nèi)很難獲得技術(shù)支持。

4. 關(guān)于碧云天化學(xué)發(fā)光EMSA試劑盒

優(yōu)點(diǎn) -- 1）非放射性，生物素/ECL系統(tǒng)，靈敏度高。2）試劑量大。3）價(jià)格低。
缺點(diǎn) -- 1）非即用型不帶探針。無EMSA經(jīng)驗(yàn)的客戶設(shè)計(jì)、制作的探針很可能不工作（探針問題解釋）。2）不帶轉(zhuǎn)運(yùn)膜，使用用于WB的NC、PVDF膜等肯定拿不到好結(jié)果。3）所使用反應(yīng)液?jiǎn)我慌浞讲荒軐?duì)EMSA結(jié)果進(jìn)行任何優(yōu)化與調(diào)整。因?yàn)樽鯡MSA實(shí)驗(yàn)時(shí)，開始可能看不到或看到很弱的結(jié)合帶，需要對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化才能獲得良好結(jié)果。但碧云天EMSA試劑盒不能對(duì)測(cè)定條件做任何調(diào)整。以常見的NFkB（右上圖）與AP-1 （右圖）EMSA為例，相同樣品與探針在不同反應(yīng)液做EMSA結(jié)合反應(yīng)，所測(cè)得的EMSA結(jié)果有很大差別。例如，兩圖中的第3泳道使用相同反應(yīng)液，在AP-1圖中看不到結(jié)合帶（右圖最上帶），但在NFkB圖中出現(xiàn)高背景（右上圖最上帶為NFkB帶）。很明顯，使用單一反應(yīng)液不能調(diào)整反應(yīng)條件，很可能導(dǎo)致失敗、信號(hào)弱、或出現(xiàn)無法解釋的結(jié)果。把單一反應(yīng)液用于成千上萬種轉(zhuǎn)錄因子/結(jié)合蛋白測(cè)定，會(huì)產(chǎn)生很多問題。

各種試劑對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的影響在 “Molecular Cloning, A Laboratory Manual” 有詳細(xì)介紹。實(shí)際操作中，不管是我們提供的EMSA技術(shù)服務(wù)還是客戶自己做測(cè)定，差不多每種轉(zhuǎn)錄因子的EMSA測(cè)定都需優(yōu)化條件才能成功。

5. 關(guān)于微奧基因 EMSA試劑盒

微奧基因 不像Thermo、Roche、Li Cor 甚至 碧云天那樣有名。但我們聚焦于轉(zhuǎn)錄因子活性檢測(cè)這一領(lǐng)域，所提供的相關(guān)產(chǎn)品類別最全、數(shù)量最多（產(chǎn)品列表）。產(chǎn)品線涵蓋了測(cè)定未知反應(yīng)條件蛋白因子的通用型以及針對(duì)特定轉(zhuǎn)錄因子測(cè)定的即用型成套試劑（比較上面表格）。微奧基因的EMSA試劑盒對(duì)所測(cè)定的TF已經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了測(cè)定條件，成功率高，價(jià)格有競(jìng)爭(zhēng)性。地表上沒有哪家公司能夠提供如此種類繁多的陽性轉(zhuǎn)錄因子對(duì)照，以及種類繁多的近紅外熒光EMSA產(chǎn)品。

從測(cè)定靈敏度與易于操作考慮，微奧基因的EMSA產(chǎn)品沒有包括基于DIG標(biāo)記的測(cè)定系統(tǒng)。微奧基因不會(huì)提供單一反應(yīng)液的EMSA產(chǎn)品。一是所有轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合都在相同化學(xué)成分、相同離子條件、相同pH條件下從來未見報(bào)道，相反大量文獻(xiàn)以及我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合在不同反應(yīng)液中有明顯差別。實(shí)際上，我們也是協(xié)助客戶調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件與反應(yīng)液成分而幫助客戶取得成功的。

微奧基因 提供各種轉(zhuǎn)錄因子活性檢測(cè)的技術(shù)服務(wù)（服務(wù)列表），使用我們產(chǎn)品與服務(wù)而發(fā)表文章有上千篇。

我們的技術(shù)支持一流，QQ:2941312161與微信:微奧基因 24小時(shí)開放。記憶中，我們還沒遇到解決不了的EMSA問題。

【D】EMSA相關(guān)產(chǎn)品的選購(gòu)（詳情）