熒光分子標記生物大分子最主要優點是能夠進行實時檢測。熒光標記蛋白(抗體)被廣泛用于生物活體示蹤,免疫熒光等領域。由于傳統熒光(FITC,HAM 等)標記的靈敏度低,熒光標記蛋白用于電泳與電泳相關技術的很少。隨著技術的進步,近紅外熒光標記大分子被發現能夠大大提高檢測靈敏度,使之達到與放射性同位素或化學發光(ECL)技術相當的靈敏度水平。熒光標記抗體逐漸被用于Western Blotting 領域,但與ECL Western Blotting 技術相比,并不能節省時間與操作步驟,仍需一天的時間出結果,省掉的只是最后沖印膠片或ECL成像的。比較而言,近紅外熒光EMSA的優點非常突出當使用近紅外分子標記的EMSA探針,EMSA變得非常簡單,快速。
傳統用放射性同位素標記探針的EMSA需要5到6天出結果,天天都要與射線打交道。基于地高辛標記的非放射性EMSA需要3天左右出結果。微奧基因的生物素標記探針的EMSA測定(濕轉膜,聯系我們索取資料)可在8小時左右出結果。以后再經過我們科學家改進,生物素標記探針的EMSA(半干轉膜,聯系我們索取資料)可在4個時左右完成。近紅外EMSA測定技術可使EMSA測定在2小時左右完成,不僅快,關鍵是操作非常簡單(查看比較幾種不同EMSA方法),使之成為遠比Western Blot測定磷酸化信號分子或免疫熒光更為簡便有效的測定轉錄因子活性的技術。近紅外熒光EMSA的優點包括:
1) 非放射性。
2) 操作十分簡單,整個操作只相當于跑一次垂直板凝膠電泳。
3) 不需要暗室。
4)不需要膠片沖洗設備與化學品耗材。
5)出結果快(2小時左右)。
6) 適合定量分析。
進行近紅外熒光EMSA需要以下試劑與設備:
A. 需要近紅外熒光掃描儀。采用熒光標記探針的非放射性EMSA一直有人試,但無法解決靈敏度低的問題。Li cor公司開發的近紅外熒光技術與相應儀器輝快了長期困擾的靈敏度問題。做近紅外熒光EMSA需要使用Li Cor公司的近紅外掃描儀(Odyssey)。國內很多大學與科研院所都已經有了Li Cor 的紅外熒光掃描。我們建議有打算做EMSA測定的客戶去問一問所在單位有沒有共享的Li Cor 掃描儀,畢竟進行紅外熒光EMSA方便快速很多。
B)需要近紅外熒光探針。在已經有Odyssey近紅外掃描儀的單位進行近紅熒光標記的EMSA還是有相當困難。一是在國內沒有任何一家應用LiCor公司的lRDye700/800進行核酸探針的公司。即使使用替代近紅外熒光(如CY5.5等)來標記探針,國內外的價格較生物素標記貴近4-5倍。例如,5 OD的探針,DNA合成公司對生物素標記的收費為300-500元/鏈,地高辛標記400-600元/鏈。而用CY5.5標記DNA鏈的價格為1500-2000元/鏈(生工網上顯示收費1500元,寶生物為2200元)。因為EMSA探針為雙鏈,實際合成探針的費用還要X2,再加上合成Olig的費用。僅僅合成帶近紅熒光寡核苷酸的費用就在4000元左右,還不包括后面雙鏈制作,純化以及比活性測定。這樣的費用使一些用戶望而卻步,寧可采用相對較便宜的生物素(化學發光)標記探針的EM
微奧基因公司已經有數十種近紅外熒光標記的EMSA探針以優惠價格(查看熒光探針目錄)出售,并可以為客戶定制個性化近紅外熒光EMSA 探針。
C)電泳設備。近紅外熒光EMSA 需要垂直板蛋白電泳裝置。對電泳裝置沒有特別要求。如果電泳裝置曾經被用于Western Blotting,必須清洗,侵泡幾天。EMSA測定的所有液體,試劑與裝置都不能有SDS。
D)近紅外熒光探針與樣品反應結合液(微奧基因的成套試劑已包括)。
E)樣品上樣液(微奧基因的成套試劑已包括)。